全自动方法合成[18F] FHBG及临床前期研究

GE Healthcare China 李宏利 齐汝海
山东省肿瘤医院 邢力刚 赵书强

随着人类基因组研究的不断深入，人类基因诊断和治疗已经成为一个快速发展的领域。但对于这个美好前景的治疗方法要应用于临床还有许多实际的工作要做。人们首先需要了解基因治疗的效果，其中对转移基因表达的体内示踪方法是关键。现在有许多不同的体内显像方法，而正电子断层扫描（PET）是这些技术中最常用的基因表达体内示踪技术。它可以提供许多精确的其它影像技术无法提供的分子水平的信息。

PET结合适当的报道基因和报道基因探针，进行体内显像，提供了大量非常有价值的信息，可解答许多关于基因治疗悬而未决的问题。PET显像可以告诉我们用于基因转移的载体是否到达靶区或其它器官组织，以及程度如何等。全身扫描也使我们能确定基因表达的生物分布，以及确定治疗是否达到预期效果。单纯疱疹病毒1型胸苷激酶（HSV1-tk）基因常用于自杀基因治疗临床实验。自杀基因可以通过重组的病毒感染靶细胞而进入恶性肿瘤细胞。HSV1-tk不但可以是治疗基因，当采用适当的探针时，也可是报道基因。近年来，人们开发出许多基因探针，它们可以浓聚于HSV1-tk表达的细胞中。利用放射性标记的探针可进行HSV1-tk基因表达的PET显像。这些探针主要分两类：I-124标记的尿嘧啶衍生物如5-[124I]iodo-2-fluoro-2-deoxy-1-?-D-arabinofuranosyl-5-iodouracil ([124I]FIAU)和F-18标记的鸟嘌呤衍生物如9-(4-[18F]Fluoro-3-Hydroxymethylbutyl)Guanine（[18F] FHBG，核苷类药物penciclovir的衍生物）。尽管在有些报道中，HSV1-tk基因表达的PET显像时，FIAU可能是一种比FHBG更有效的探针，但I-124不易获得，成为FIAU临床应用的最大障碍。这样，[18F] FHBG可能是最具前景的一种。[18F]FHBG作为放射性标记的核苷探针，可用于监测基因治疗效果。下面我们就介绍一下采用Tracerlab FXFN全自动化合成[18F]FHBG的方法及临床前初步研究。

一、材料和方法 Kryptofix 2.2.2，K2CO3和溶剂可从Merck公司购买。QMA和C18 Sep-pak柱为Waters公司产品。前体物质N2-(p-anisyldiphenylmethyl)-9-[(4-(p-toluenesulfonyloxy))-3-p-anisyldiphenylmethoxymethylbutyl]guanine（Tosyl-FHBG）可从ABX公司购买。

二、反应原理

二、反应原理



合成步骤：
标记采用GE Tracerlab FXFN全自动化学合成器（见图1.）。

1、[18F]氟化物由GE公司MINITrace通过18O(p,n)18F反应生产。用氦气将照射后的富氧水传入合成器接收瓶中。
2、回收 [18O]水后，18F-离子保留在阴离子交换柱（QMA）上。使用K2CO3 （3 mg溶于0.5 ml水）和Kryptofix 2.2.2.（15 mg溶于1 ml乙腈）混合溶液将 [18F]氟化物洗脱，进入的反应瓶中，溶液通过85°C蒸发干燥。水汽由置于液氮中的冷阱吸收。
3、前体（Tosyl-FHBG，3 mg溶于1 ml DMSO）溶液进入反应瓶，150°C加热20分钟。
4、反应液冷却后用4 ml水稀释，然后通过一个C18 Sep-pak柱（5 ml CH3OH活化，10 ml去离子水冲洗），用3 ′ 4 ml冲洗，弃置废液，最后用2 ml CH3OH洗脱。
5、HCl（1 N，0.4 ml）溶液进入反应瓶，110°C加热10分钟，进行水解。
6、NaOH（1 N，0.18 ml）进入反应瓶，中和混合液。
7、粗产品用1.3 ml HPLC淋洗液稀释。
8、初产品进入HPLC分离模块，进一步纯化（洗脱液NH4OAc（50 mmol/L）/C2H5OH 93/7，v/v，流速5 ml/min，紫外254 nm，放射性和紫外线同时监测）。当系统检测到HPLC处放射性计数达到设定阈值后，自动开始收集，得到最终产物（见图2.）。 最后得到产物[18F]FHBG，放化产率10-15%（未校正）。

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合成步骤： 合成步骤：  

三、[18F]FHBG临床前显像
使用兔子做为临床前期实验动物。检查前将兔子麻醉，经耳缘静脉注入[18F]FHBG 1mCi 后，采用3D模式进行动态扫描，动态扫描设定为30秒X6，60秒X5、90秒X6、300秒X8 ，在注射示踪剂60分钟后进行静态扫描显像。从图3可见兔肝肾部位见及较少的浓聚（药物经肝代谢所致）。

三、[18F]FHBG临床前显像



四、讨论
对于日常的PET药物合成，生产的全自动化不仅是出于辐射防护的考虑，同时是获得可重复性结果最有效的方法，还能提高整个流程的效率，减少人为的错误，最后使整个生产过程符合GMP要求。有报道采用手动方法合成[18F]FHBG（合成条件基本同前面提到的方法，只是省略了水解步骤前采用C18 Sep-Pak柱分离初产品的步骤），合成时间（包括标记、水解、分离纯化）需90-95分钟，产率为9%，放化纯度仅为95%。这显然不符合临床使用的要求。而采用Tracerlab FXFN全自动合成器，相同反应条件，时间可缩短为50分钟左右，并且可以得到高的放化纯度（>99%），产率也提高到15%。我们摸索反应条件，还可将合成时间进一步缩短到45分钟。Tracerlab FXFN 采用计算机控制全程工作，包括加热、降温、传输、分离等，极大的缩减了上述过程的时间，提高了放化纯，并且反应在一个密闭的系统中进行，保证最终产品即为注射溶液，完全可满足临床的日常需要。[18F]FHBG全自动合成方法的开发成功将极大的加速基因诊断、治疗的临床应用过程。目前，我们国内已经有超过40台已经安装的PCT（PET/CT），所以[18F]FHBG全自动合成方法的成功对于临床开展基因诊断、治疗具有特别重要的意义。

参考文献：
1．Iván Pe?uelas, José F. Boán, Josep M. Martí-Climent, A Fully Automated One Pot Synthesis of 9-(4-[18F]Fluoro-3-Hydroxymethylbutyl)Guanine for Gene Therapy Studies, Molecular Imaging Biology, 4: 415-424, 2003.
2. Grace G. Shiue, Chyng-Yann Shiue, Roland L. Lee, A simplified one-pot synthesis of 9-[(3-[18F]Fluoro-1-hydroxy-2-propoxy)methyl]guanine([18F]FHPG) and 9-(4-[18F]Fluoro-3-hydroxymethylbutyl)guanine ([18F]FHBG) for gene therapy, Nuclear Medicine and Biology, 28: 875-883, 2001.
3. 魏道严, 陈诗书, 核医学技术在实验性基因治疗中的应用研究, 中华核医学杂志, 1999年第19卷第4期。